This article is based on a part of the first author's doctoral dissertation from Ewha Womans University.
This article was supported by the Korea Academy of Fundamentals of Nursing academic support program fund in 2020.
이 논문은 제1저자 이임선의 박사학위논문의 일부를 발췌한 것임.
본 연구는 2020년도 기본간호학회 학술지원사업에 의해 수행되었음.
The purpose of this study was to examine the effect of laughter therapy on the quality and quantity of sleep in elders with sleep disorders.
This was a quasi-experimental study using a non-equivalent control group pretest-posttest design with 59 participants and included elders with sleep disorders, The Pittsburgh Sleep Quality Index (PSQI) scores of five or more points were: 29 in the experiment group and 30 in the control group. The experimental group participated in laughter therapy sixteen times, twice a week for 50 min per session for 8 weeks.
The results showed that laughter therapy was effective according to the PSQI (F=86.13,
The results of the study indicate that laughter therapy may be an effective nursing intervention to improve quantity and quality of sleep in community-dwelling elderly.
수면장애는 세계 인구의 10% 정도가 경험하고 있는 질환으로 충분한 수면을 취하지 못하거나 수면리듬이 흐트러져 잠을 자거나 깨어 있을 때 어려움을 겪는 상태를 포함하는 포괄적 개념이다[
수면장애를 완화시키기 위한 중재로는 약물요법과 비약물요법이 주로 적용되고 있다. 약물요법은 빠른 시간에 효과를 볼 수 있는 장점이 있으나 깊은 수면시간의 감소, 병용 약물과의 상호작용, 약물에 대한 신체 및 심리적 의존, 낙상과 사망률의 증가 등 많은 부작용을 유발하는 단점이 있다[
특히, 자기공명 영상(Magnetic Resonance Imaging, MRI)을 통해 웃음요법은 체감각 영역에 해당되는 뇌 중심뒤이랑(Postcentral Gyrus)을 활성화시키고, 고차원적인 인지 기능과 관련된 대뇌의 변연계 및 시상 영역을 활성화시키는 것이 확인되었다[
본 연구의 목적은 수면장애가 있는 재가노인에게 웃음요법을 적용하여 수면에 미치는 효과를 확인하기 위함이며 노인의 수면 문제 완화를 위한 간호중재로 활용하고자 한다.
본 연구의 구체적인 목적은 다음과 같다.
• 웃음요법이 재가노인의 주관적 및 객관적 수면 지표에 미치는 효과를 확인한다.
• 웃음요법이 재가노인의 혈중 멜라토닌 농도에 미치는 효과를 확인한다.
• 가설 1. 웃음요법을 적용받은 중재군과 대조군의 수면의 주관적 지표점수는 차이가 있을 것이다.
• 가설 2. 웃음요법을 적용받은 중재군과 대조군의 수면의 객관적 지표 점수는 차이가 있을 것이다.
• 가설 3. 웃음요법을 적용한 중재군은 대조군보다 멜라토닌 농도의 변화량에 차이가 있을 것이다.
본 연구는 웃음요법이 수면장애를 가진 재가노인의 주관적, 객관적 수면 상태와 멜라토닌 농도에 미치는 효과를 검정하기 위한, 비동등성 대조군 사전사후 설계의 유사실험연구이다(
CONSORT flow diagram of the study.
본 연구의 대상자는 I시에 소재한 노인복지 시설 및 평생교육원을 방문하는 노인으로 연구의 취지와 방법에 대한 설명을 듣고 웃음요법 중재에 참여하기로 동의한 자로 노년기의 대표적인 만성질환인 고혈압, 당뇨, 근골격계 질환 등의 병력이 있는 경우도 포함하였다. 노인복지시설과 평생교육원 총 6곳을 선정하여 기관장의 허락을 받고 모집 문건을 게시하거나 전화 상담을 통해 대상자를 모집하였다. 실험확산의 가능성을 배제하기 위해 중재군과 대조군 각각 3곳으로 나누어 중재를 시행하였다. 본 연구 기간은 2020년 7월 28일부터 9월 28일까지였으며, 구체적인 선정기준과 제외기준은 아래와 같다.
연구대상자 선정기준은 다음과 같다.
• 65세 이상의 수면장애를 호소하는 자(Korean version of the Pittsburgh Sleep Quality Index PSQI-K)점수가 5점 초과인 자)
• 단축형 간이정신상태검사(Korean version of Mini-Mental State Exam, MMSE-K) 점수가 24점 이상으로 인지 기능이 정상인 자
연구대상자 제외기준은 다음과 같다.
• 수면 조절을 위해 다른 보완대체요법을 받고 있는 자
• 수면제 또는 항우울제를 복용하는 자
수면의 주관적 지표는 Buysse 등[
수면의 객관적 지표는 손목에 착용하는 수면활동기록계(Fitbit fitbitⓇ Inc., San Francisco, California, USA)을 이용하여 측정하였고, 수면활동기록계는 신체활동에 따른 수면의 질 측정에 대한 신뢰도와 타당도가 검증되어 수면과 관련된 연구에 널리 사용되고 있다[
혈중 멜라토닌 검사는 오후 5시에서 6시 30분 사이로 교육장 휴게실에서 본 연구자가 직접 연구대상자의 팔오금중간정맥(Median cubital vein)에서 혈액 4 cc를 채취한 후 임상병리사가 3,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하였다. 원심분리 된 혈청은 초저온 냉동고(deep freezer)에 보관한 후에 효소면역측정법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)검사법을 시행하였으며, 멜라토닌 ELISA human kit (IBL, Germany)와 Microplate reader VERSA Max (Molecular device, USA)장비를 이용하여 멜라토닌 농도를 측정하였다.
중재를 적용하기 전 중재군과 대조군에게 설문조사(일반적 특성, 질병 관련 특성, 수면의 주관적 지표)와 혈액채취 및 수면의 객관적 지표(수면활동기록계)를 조사하였다. 수면활동기록계는 보조연구원이 오후 6시부터 착용하도록 했으며, 24시간이 경과한 뒤 데이터를 수집하였다. 감염 예방을 위해 교육장 입구에서 체온을 측정하여 정상군만 입장하였고, 질병관리청의 COVID-19 예방 지침에 따른 규정을 준수하였다.
웃음요법은 매회 총 50분 중 도입 단계 10분, 실제 단계 30분, 마무리 단계 10분으로 진행하였다. 매일 그날 배운 것 중 한 가지 과제를 포함하여 생활 속에서도 웃음요법을 적용할 수 있게 하였다. 실험처치는 표준화된 웃음 프로그램[
Sixteen-Session Laughter Program for Elders with Sleep Disorders
Weeks | NO. | Introduction (10 min) | Laughter therapy (30 min) | Wrapping up (10 min) | Home work |
---|---|---|---|---|---|
1st | 1 | Share a laugh greeting | ‐ Facial muscle relaxation |
• Self-expression |
‐ Salivary Gland Stimulation Laughter |
2 | Share a laugh greeting | ‐ Laugh sticker |
• Self-expression |
‐ Laughing Lion | |
2nd | 3 | Share a laugh greeting | ‐ Hwahoe Mask mask laughter |
• Self-expression |
‐ Hwahoe Mask laughter |
4 | Share a laugh greeting | ‐ Love of Baktagi laugher |
• Self-expression |
‐ Snow white Princess laughter | |
3th | 5 | Share a laugh greeting | ‐ Praise Laughter 1. 2. Step |
• Self-expression |
‐ Rubbing laughter |
6 | Share a laugh greeting | ‐ Dementia prevention laughter |
• Self-expression |
‐ Knee reflex laughter | |
4th | 7 | Share a laugh greeting | ‐ Laugh bomb using balloons |
• Self-expression |
‐ Humming bird Laughter |
8 | Share a laugh greeting | ‐ Shower laughter 1, 2, 3 steps |
• Self-expression |
‐ Peacock Bird dance | |
5th | 9 | Share a laugh greeting | ‐ Sea urchin and sea urchin dance |
• Self-expression |
‐ Mantis dance |
10 | Share a laugh greeting | ‐ Laundry laugh and washing machine laugh |
• Self-expression |
‐ Shawl Lizard laughing t | |
6th | 11 | Share a laugh greeting | ‐ All together −>3 people −>2 people −>1 person laugh |
• Self-expression |
‐ Kangaroo Laughter |
12 | Share a laugh greeting | ‐ Cicada laughter 1, 2, 3 steps |
• Self-expression |
‐ Rooster laugh | |
7th | 13 | Share a laugh greeting | ‐ Gapdol and Gapsun laugh |
• Self-expression |
‐ Horse riding laughter |
14 | Share a laugh greeting | ‐ 100 years old healthy breathing massage |
• Self-expression |
‐ Stingray Dance | |
8th | 15 | Share a laugh greeting | ‐ Shake and laugh exercise |
• Self-expression |
‐ Emperor Penguin Laughter |
16 | Share a laugh greeting | ‐ Laugh surfing steps 1, 2, 3 |
• Self-expression |
‐ Snail Dance |
중재군과 대조군 모두 웃음요법을 시작하고 4주후에 사전 조사와 동일한 시간에 시행하였다. 주관적 수면의 질(PSQI-K 설문지)과 객관적 수면 측정도구인 수면활동기록계를 1일간 착용하여 총수면시간, 수면 잠복기, 수면효율, 수면 중 각성횟수, 얕은 수면시간, 깊은 수면시간, REM 수면시간을 측정하여 조사하였다.
8주 동안 총 16회기의 모든 처치가 끝난 후에 중재군과 대조군의 사후 조사를 시행하였다. 사전 조사와 동일한 PSQI-K 설문지, 동일한 수면활동기록계를 착용하여 총 수면시간, 수면 잠복기, 수면효율, 수면 중 각성횟수 측정, 얕은 수면시간, 깊은 수면시간, REM 수면시간을 측정하였고, 멜라토닌은 사전과 같은 시간에 채혈을 실시하였다.
수집된 자료는 SPSS/WIN 24.0 프로그램을 이용하여 분석하고, 통계적 유의성은
본 연구는 연구를 시작하기 전 연구계획서의 윤리적 타당성을 검증받기 위해 이화여자대학교 기관 생명윤리위원회의 심의 승인(No. ewha-202007-0021-01)을 받은 후 진행하였다. 연구 시작 전 연구의 배경과 목적, 방법에 대해 설명한 후 대상자의 자발적 동의를 얻은 후 연구를 진행하였다. 연구 도중 모든 자료는 비밀이 보장되는 것과 설문 도중에라도 연구에 동의하지 않아도 불이익을 받지 않으며 참여해야 할 의무는 없고 본인이 원치 않는 경우 참여 의사를 언제든지 철회할 수 있음을 상세하게 알려주었다. 연구대상자에게 연구참여자 동의서는 연구대상자가 이해하기 쉬운 용어와 글자의 크기로 준비하고 연구의 목적과 내용, 진행 절차에 대해 설명한 후 연구참여에 대한 서면 동의서를 받았다. 연구 종료 후 대조군에게도 웃음요법 프로그램을 1회 적용하였다.
본 대상자는 중재군 29명, 대조군 30명으로 총 59명이었다. 각 집단의 연령의 분포는 66세에서 80세이며, 평균연령이 중재군이 71.00±4.45세, 대조군은 72.43±5.10세로 나타났다(t=−1.15,
Homogeneity of Characteristics of Participants (
Variables | Categories | Exp. (n=29) |
Con. (n=30) |
|||
---|---|---|---|---|---|---|
n (%) or M±SD | n (%) or M±SD | |||||
Age (year) | 71.00±4.45 | 72.43±5.10 | −1.15 | .255 | ||
Gender | Male |
0 (0.0) |
3 (10.0) |
.237 |
||
Education | ≤High school |
20 (69.0) |
25 (83.3) |
1.68 | .233 | |
Occupation | Yes |
7 (24.1) |
9 (30.0) |
0.26 | .613 | |
Spouse | Survival |
24 (82.8) |
12 (40.0) |
3.72 | .084 | |
Comorbid diseases | High blood pressure | Yes |
10 (34.5) |
16 (53.3) |
2.22 | .145 |
Diabetes | Yes |
7 (24.1) |
6 (20.0) |
0.15 | .701 | |
Musculoskeletal disease | Yes |
4 (13.8) |
4 (13.3) |
.627 |
||
Etc | Yes |
4 (13.8) |
2 (6.7) |
.424 |
||
Oral medication | High blood pressure | Yes |
10 (34.5) |
16 (53.3) |
2.22 | .145 |
Diabetes | Yes |
7 (24.1) |
6 (20.0) |
0.15 | .701 | |
Musculoskel-etal disease | Yes |
2 (6.9) |
3 (10.0) |
.516 |
||
Etc | Yes |
3 (10.3) |
1 (3.3) |
.353 |
Con.=control group; Exp.=experimental group;
Fisher's exact test.
대상자의 수면 관련 주관적 지표(PSQI-K), 객관적 지표(총 수면시간, 수면효율, 수면 잠복기, 수면 중 각성횟수, REM 수면시간, 얕은 수면시간, 깊은 수면시간), 혈중 멜라토닌 농도의 Shapiro-Wilk’ s test로 정규성 검정을 하였다. 검정 결과 PSQI-K, 총 수면시간, 수면효율, 수면 중 각성횟수, REM 수면시간, 얕은 수면시간, 깊은 수면시간은 정규분포를 따랐으며(중재군
Homogeneity and Normality Test of Variables (
Variables | Categories | Exp. (n=29) |
Cont. (n=30) |
t or Z | Exp. (n=29) |
Cont. (n=30) |
|||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
M±SD | Median (Q1∼Q3;IQR) | M±SD | Median (Q1∼Q3;IQR) | Shapiro-Wilk | Shapiro-Wilk | ||||||
Subjective indicator | PSQI-K | 14.52±2.73 | 15.00 (13.00∼16.50; 3.50) | 15.60±2.10 | 16.00 (4.00∼17.00; 3.00) | −1.71 | .409 | .965 | .426 | .943 | .112 |
Objective indicators | TST (min) | 345.52±85.75 | 347.00(286.50∼407.00;120.50) | 382.63±75.48 | 379.00(330.00∼434.25;104.25) | −1.77 | .083 | .974 | .659 | .973 | .633 |
SE (%) | 68.57±9.77 | 69.83(60.33∼75.97;15.64) | 70.16±8.75 | 70.35(63.94∼76.55;12.61) | −0.66 | .513 | .944 | .129 | .964 | .399 | |
SOL (min) | 50.21±21.11 | 51.00(28.50∼72.00; 43.50) | 56.83±35.74 | 52.50(32.75∼67.75;35.00) | −0.43 |
.666 | .957 | .281 | .802 | <.001 | |
NWAK | 4.82±1.61 | 5.00(3.50∼6.00;2.50) | 4.97±1.77 | 5.00(3.75∼6.00;2.25) | −0.32 | .753 | .933 | .066 | .932 | .057 | |
REM sleep | 71.38±30.24 | 73.00(48.50∼97.00;48.50) | 71.10±32.60 | 68.50(43.00∼100.25;57.25) | 0.03 | .973 | .970 | .555 | .933 | .059 | |
Light sleep | 224.03±59.00 | 227.00(180.50∼272.00;91.50) | 239.77±58.29 | 236.00(195.50∼290.50;95.00) | −1.03 | .307 | .971 | 592 | .963 | .365 | |
Deep sleep | 61.17±22.44 | 63.00(41.50∼79.50;38.00) | 62.60±23.81 | 62.00(44.50∼84.00;39.50) | −0.07 | .944 | .974 | .672 | .971 | .555 | |
Blood test | Melatonin (pg/mL) | 4.74±2.06 | 4.13(3.22∼4.97;1.75) | 4.86±1.79 | 4.30(3.43∼6.06;2.63) | −0.68 |
.494 | .773 | <.001 | .871 | .002 |
Cont.=control group; Exp.=experimental group; IQR=interquartile range; NWAK=number of awakening; PSQI=Pittsburgh sleep quality index; REM=rapid eye movement; SE=sleep efficiency; SOL=sleep onset latency; TST=total sleep time;
Mann-Whitney U test.
중재군과 대조군의 수면의 주관적 지표(PSQI-K)의 자료는 구형성 가정을 충족하지 않아(
Comparison of Sleep Related Dependent Variables between Groups (
Variables | Group | Baseline |
Week 4 |
Week 8 |
χ2 (p) | G |
T |
G∗T |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
M±SD or Median (Q1∼Q3;IQR) | M±SD or Median (Q1∼Q3;IQR) | M±SD or Median (Q1∼Q3;IQR) | F ( |
F ( |
F ( |
|||
PSQI-K | Exp. |
14.52±2.73 |
11.28±2.45 |
9.90±2.19 |
160.62 (<.001) | 3.66 (.038) | 86.13 (<.001) | |
TST (min) | Exp. |
345.52±85.75 |
372.10±73.37 |
410.07±85.38 |
0.001 (.981) | 1.77 (.174) | 9.34 (<.001) | |
SE (%) | Exp. |
68.57±9.77 |
75.58±8.22 |
83.70±4.87 |
43.48 (<.001) | 0.67 (.512) | 45.34 (<.001) | |
SOL (min) | Exp. | 50.21±21.11 |
33.52±33.15 |
27.38±20.73 |
13.88 |
|||
Cont. | 56.83±35.74 |
75.67±32.82 |
80.73±38.10 |
11.95 |
||||
NWAK | Exp. |
4.82±1.61 |
4.72±1.93 |
3.34±1.26 |
22.81 |
6.33 |
31.32 |
|
REM sleep (min) | Exp. |
71.38±30.24 |
74.55±25.49 |
83.69±24.55 |
0.08 (.774) | 1.80 (.184) | 0.27 (.635) | |
Light sleep (min) | Exp. |
224.03±59.00 |
233.78±87.84 |
263.97±70.09 |
2.08 (.155) | 0.33 (.717) | 5.09 (.008) | |
Deep sleep (min) | Exp. |
61.17±22.44 |
56.07±23.98 |
77.79±25.62 |
3.85 (.055) | 4.41 (.014) | 15.13 (<.001) | |
Melatonin (pg/mL) | Exp. | 4.74±2.06 |
6.17±1.82 |
−3.23 (.001) | −3.90 (<.001) | |||
Cont. | 4.86±1.79 |
4.44±1.34 |
−1.35 (.178) |
Cont.=control group; Exp.=experimental group; G=group; G∗T=group∗time; NWAK=number of awakening; PSQI=Pittsburgh sleep quality index; REM=rapid eye movement; SE=sleep efficiency; SOL=sleep onset latency; T=time; TST=total sleep time;
Friedman test.
수면의 객관적 지표 중 총 수면시간은 구형성 가정을 충족하여(
수면 효율은 구형성 가정을 충족하여(
수면 잠복기의 시점 간 중위수의 변화는 중재군에서 중재 전 51분에서 중재 4주 후 26분, 중재 8주 후 21분으로 수면 잠복기가 감소하여 수면 양상이 호전되었고, 통계적으로 유의하게 나타났으나 (x2=13.88,
수면 중 각성횟수는 구형성 가정을 충족하지 않아(
REM 수면은 구형성 가정을 충족하지 않아(
마지막으로, 깊은 수면시간은 구형성 가정을 충족하여(
따라서 웃음요법을 적용받은 중재군의 REM 수면을 제외한 총 수면시간, 수면 효율, 수면 잠복기, 수면 중 각성 횟수, 얕은 수면, 깊은 수면의 점수는 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 나타나, 가설 2는 부분적으로 지지되었다.
혈중 멜라토닌 수치의 변화량은 중재군은 중재 전 4.74에서 중재 8주 후 6.17점으로 증가하였고, 대조군은 중재 전 4.86에서 중재 8주 후 4.44로 감소하였으며, 웃음요법을 적용받은 중재군의 멜라토닌 변화량은 대조군에 비해 집단 간 전 ․ 후에 통계적으로 유의한 차이가 있었다(Z=−3.90,
본 연구에서는 재가노인을 대상으로 총 8주 동안 웃음요법을 적용하였으며, 수면에 대한 웃음요법의 효과를 객관적 지표를 통해 확인하여 과학적 근거를 제시하였다는 점에서 의의가 있다. 연구결과를 바탕으로 다음을 논의하고자 한다.
본 연구에서는 수면에 대한 웃음요법의 효과를 검정하기 위해 주관적 도구인 PSQI-K와 객관적 도구인 수면활동기록계, 혈중 멜라토닌 농도를 이용하여 확인하였다. 연구결과 웃음요법을 적용한 중재군과 대조군의 수면의 주관적 지표 점수인 PSQI-K는 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 본 연구결과는 8주간의 웃음요법이 재가노인의 수면의 질을 향상시킨다는 것을 의미하며, 이러한 결과는 지역사회 재가노인을 대상으로 4주간 주 1회(50분)의 웃음요법 적용 후 PSQI-K 점수가 감소하고[
본 연구에서 수면의 객관적 지표는 수면활동기록계를 사용하여 측정하였다. 하부 영역은 총 수면시간, 수면 효율, 수면 잠복기, 수면 중 각성 횟수, REM 수면, 얕은 수면, 깊은 수면으로 본 연구결과 REM 수면을 제외한 6가지 영역에서 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 수면장애 환자의 치료 목표는 총 수면시간 360분 초과, 수면 효율 80~85% 이상 유지, 수면 잠복기는 30분 미만을 유지하도록 권고하였는데[
중재 8주후 웃음요법을 적용한 중재군과 대조군의 혈중 멜라토닌을 측정한 결과 중재 8주후 웃음요법을 적용한 중재군과 대조군의 혈중 멜라토닌을 측정한 결과 유의하게 증가하였고, 중재군과 대조군간에 통계적으로 유의한 차이가 나타났다. 본 연구대상자의 중재 전 멜라토닌 농도는 중위수 4.13 pg/ml 으로, 재가노인의 20.93 pg/dL [
본 연구의 웃음요법은 웃음소리, 웃음운동, 웃음명상을 포함한 중재로 표준화된 웃음요법 프로그램으로 대조군에게 웃음요법 교육 책자를 제공하여 웃음요법 효과를 비교한 결과 웃음요법 프로그램에 참여한 것이 수면에 효과가 있었다. COVID-19 유행 동안 발표된 41개의 논문을 종합하여 사회적 거리 두기가 노인의 정신 및 신체 건강에 미치는 효과를 확인한 선행연구에서도 노인은 사회적 거리 두기에 특히 취약하며, 불안, 우울, 수면, 신체활동 수준 감소 등을 호소하고 있다고 하였다[
본 연구의 제한점으로 여름의 장마와 초가을이라는 계절 변화 및 COVID-19와 관련하여 사회적 거리 두기로 외출이 거의 없거나 줄어든 상황으로 생활습관의 급격한 변화라는 외생변수를 완벽하게 제한할 수 없었다는 점이다. 또한 웃음요법을 적용하여 수면과 관련된 생리적 지표로 멜라토닌을 측정한 연구는 전무하므로 향후 연구에서는 시간을 달리하거나 시작 전, 중간, 사후 등 여러 차례 시간차를 두어 검사를 시행하여 멜라토닌 분비의 리듬적 변화 및 총량을 파악하는 것이 필요하다고 사료된다.
본 연구는 수면장애가 있는 재가노인에게 안전하고 효과적인 웃음요법을 적용하여 수면에 미치는 효과를 알아보고자 시행하였다. 본 연구결과 웃음요법은 재가노인의 수면의 주관적 지표 및 객관적 지표, 혈중 멜라토닌 농도를 개선하고 수면을 증가시키는데 효과적인 간호중재임을 확인하였다, 따라서 웃음요법의 수면에 미치는 효과를 주관적 지표뿐 만이 아니라 객관적 지표로 검정하여 과학적 근거를 제시하였으므로, 임상 및 지역사회에 확대 적용하여 약물요법이 제한적인 노인에게 효과적으로 활용할 수 있음을 기대한다. 이상의 결과를 바탕으로 다음을 제언하고자 한다.
첫째, 본 연구는 웃음요법 당일 수면장애 재가노인의 종속변수를 측정하여, 심리적 상태로 인한 우울이나 불안, 스트레스 등 외부요인을 통제하지 못했다. 따라서 노인의 수면에 영향을 미치는 종속변수를 측정하여 웃음요법의 효과를 재검정하기를 제언한다. 둘째, 본 연구결과 웃음요법이 재가노인의 수면에 효과가 있는 것으로 나타났으므로, 노인의 수면 개선을 위한 간호중재로 활용 할 것을 제언한다.
Hyojung Park has been editor-in-chief Journal of Korean Academy of Fundamental of Nursing since January 2020. She was not involved in the review process of this manu-script. Otherwise, there was no conflict of interest.